分光光度計是利用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析的儀器。根據(jù)電磁輻射原理，不同的物質(zhì)有不同的吸收選擇，即不同的吸收光譜。分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物實驗室的常規(guī)儀器。常用于核酸、蛋白質(zhì)定量和細菌生長濃度的定量。該儀器主要由光源、單色、樣品室、探測器、信號處理器、顯示和存儲系統(tǒng)組成。

許多化學物質(zhì)都有顏色，一些無色化合物也可以與顯色劑一起生成有色物質(zhì)。實踐證明，有色溶液濃度越大，顏色越深；濃度越小，顏色越淺。因此，有色溶液的濃度可以通過比較溶液的顏色深度來確定，并定量分析溶液中所含的物質(zhì)?；诒容^顏色深度對溶液進行定量分析的方法稱為比較顏色分析。

分光光度法是定性和定量分析被測物質(zhì)在特定波長或一定波長范圍內(nèi)的吸收度。常用的波長范圍為：

(1)200～400nm紫外光區(qū)；

(2)400～760nm可見光區(qū)；

(3)2.5～25μm(波數(shù)為4000cm<-1>～400cm紅外光區(qū)-1>)。

所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計（或比色度計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精度和準確性，所有儀器應(yīng)按照國家計量驗證程序或本附錄的規(guī)定進行定期校正和驗證。

包括4000波長范圍~760nm可見光區(qū)和波長范圍為200~400nm的紫外光區(qū).不同的光源有其獨特的發(fā)射光譜，因此可以使用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.

鎢燈發(fā)射光譜:鎢燈光源發(fā)出的400~760nm波長光譜光經(jīng)三棱鏡折射后，可獲得紅橙、黃綠、靛藍、紫色組成的連續(xù)色譜；該色譜可作為可見光分光光度計的光源.

氫燈發(fā)射光譜：氫燈發(fā)射185~400nm波長光譜可作為紫外光光度計的光源.

物質(zhì)吸收光譜

如果某種物質(zhì)的溶液放置在光源和棱鏡之間，屏幕上顯示的光譜不再是光源的光譜。它有幾條暗線，即光源發(fā)射光譜中的一些波長光因溶液吸收而消失。這種被溶液吸收的光譜稱為溶液的吸收光譜.

不同物質(zhì)的吸收光譜不同.因此，溶液中所含的物質(zhì)可以通過吸收光譜來識別.

物質(zhì)吸收光譜

當光通過某種物質(zhì)的溶液時，光的強度減弱.由于部分光反射或分散在溶液表面，部分光被形成溶液的物質(zhì)吸收，只有部分光可以通過溶液.

入射光=反射光+分散光+吸收光+透過光

如果我們使用蒸餾水（或組成溶液的溶劑）作為"空白"因反射、分散等因素造成的入射光損失：

入射光=吸收光十透過光

分光光度計采用能產(chǎn)生多波長的光源，通過一系列分光裝置產(chǎn)生特定波長的光源。測試樣品后，部分光被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化為樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

當單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被測物質(zhì)吸收的量與物質(zhì)濃度和液層厚度（光路長度）成正比，其關(guān)系如下：

A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc

式中:A為吸光度；

I。入射單色光強度；

I單色光強度為透射；

T物質(zhì)的透射率；

k摩爾吸收系數(shù)；

L對于被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長

c物質(zhì)濃度

物質(zhì)對光的選擇性吸收波長和相應(yīng)的吸收系數(shù)是物質(zhì)的物理常數(shù)。當已知的純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)時，可以在相同條件下將試驗產(chǎn)品分配到溶液中，以確定其吸收程度，然后從上述公式計算試驗產(chǎn)品中物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)域，除了某些物質(zhì)吸收光外，許多物質(zhì)本身并沒有被吸收，但可以在一定條件下添加顯色試劑或經(jīng)過處理后進行測量，因此也稱為顏色比較分析。由于顯色影響顏色深度的因素較多，經(jīng)常使用單色光純度較差的儀器，標準產(chǎn)品或控制產(chǎn)品應(yīng)同時操作。

為什么溶液有顏色，為什么顏色和濃度有關(guān)？這個問題將在下面討論。

一、光的互補性和有色物質(zhì)的顯色原理

1.光的波粒二象性

光是電磁波的表現(xiàn)形式。光線在真空中直線傳播，反射、折射、衍射、色散、干擾和偏振發(fā)生在不同的介質(zhì)上?？梢杂貌ㄩL、頻率、傳播速度等參數(shù)來描述，即光具有“波動性”。光的顏色由光的波長決定，人眼能感覺到的光稱為可見光，波長在400~750nrn之間。紅外光和紫外光除可見光外。同時，光也有“粒子性”光電效應(yīng)就是一個很好的例子。光的粒子性理論認為，光是由“光子”（或稱“光量子”）所組成。當輻射能量時，光以能量E的形式輻射，當光被吸收時，能量也被吸收。每一種能量的大小是hυ。光子能量與波長的關(guān)系是E=hυ=hc／λ，E是光子的能量（J：焦耳），υ為頻率，h為普朗克常數(shù)(6).63×10-34J?S），c為光速，λ光的波長。因此，不同波長的光能量不同，短波能量大，長波能量小。

2.光的顯色原理

如果將兩種顏色的光與一定的強度比混合得到白光，則這兩種顏色的光稱為互補色。圖1中的兩種直線光是互補的顏色。如綠色和紫色是互補的顏色，黃色和藍色是互補的顏色等。

由于溶液中有色質(zhì)點（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光，各種溶液呈現(xiàn)出不同的顏色。實驗證明，溶液呈現(xiàn)的顏色是吸收光的主要互補顏色。例如，當一束白光通過高錳酸鉀溶液時，大多數(shù)綠光被選擇吸收，其他光通過溶液。從互補色示意圖可以看出，透光中只有紫色光，因此高錳酸鉀溶液呈紫色。

二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律

吸收定律可以描述溶液顏色的深度和濃度之間的關(guān)系。它由朗伯定律和比爾定律組成，因此被稱為朗伯比爾定律。原子吸收分光光度計也符合這一定律。

當一束強度為I的平行單色光照射到溶液中時，部分光被溶液吸收，部分光被界面散射，其余光通過溶液，如圖2所示

有：I0=Ia+Ir+It

I0-入射光強度

Ia--吸收光強度

Ir--反射光強度

It--透射光強度

通常由于Ir它很小，可以忽略不計。上式可以簡化為

I0=Ia+It

透射光It入射光強度I0之比為透光率或透光率，用T表示：

T=It/Ia

透光率的負對數(shù)稱為吸光度、光密度或消光度，用A表示：

A=－lgT=lg1/T=lgIa/It

吸光越大，物質(zhì)對光的吸收越強。透光度和吸光度都用來表示入射光的吸收程度，它們之間可以相互轉(zhuǎn)換。

實驗表明，當單色光通過有色溶液時，透過溶液的光強度不僅與溶液的濃度有關(guān)，還與溶液的厚度和溶液本身對光的吸收性能有關(guān)。其規(guī)則可以用以下模式表示A＝KCL式中：A（E）——吸光度(或光密度，也可以用D表示)；K——消光(吸收)系數(shù)；C——溶液濃度；L——光程，即溶液的厚度。

消光系數(shù)K是一個常數(shù)。有色溶液對一定波長（單色光）的入射光K值具有一定的值。如果溶液濃度以摩爾/升表示，溶液厚度以厘米表示，則此時的K值稱為摩爾消光系數(shù)。摩爾消光系數(shù)是有色化合物的重要特征之一。顯色反應(yīng)的靈敏度可以根據(jù)該值的大小進行估計。

從上面的風格可以看出，當K和L不變時，光密度E與溶液濃度C成正比。也可以說，當一束單色入射光通過有色溶液并入射光時，消光系數(shù)和溶液厚度不變，吸光度A隨溶液濃度而變化。

這種單色光和有色溶液之間的關(guān)系被稱為朗伯比爾定律。光電比色計和分光光度計的比色分析是基于這一定律。然而，朗伯比爾定律只適用于單色光和低濃度的有色溶液。

三、應(yīng)用朗伯-比爾定律

1.等吸光法

從朗伯比耳定律可以看出，當同一光源照射同一物質(zhì)的不同濃度溶液時，如果吸光度相等，則兩種溶液的濃度和透光層厚度的乘積也相等。利用這種關(guān)系，可以在可見光區(qū)找到待測溶液的濃度（視覺色法）。

2．計算法

根據(jù)測量溶液濃度的一般范圍，首先制備已知濃度的標準溶液。用同樣的方法處理標準溶液和測量溶液，在相同的實驗條件下用相同的儀器測量其吸光度。

標準溶液：As=KsCsLs

待測溶液：Ax=KxCxLx

如果在測量時選擇相同厚度的比色皿使L相等，并使用相同波長的單色光來保持相同的溫度，則K也相等。除去兩種類型As/Ax=Cs/Cx

由此可見，在滿足上述條件下，吸光度與溶液成正比。如果設(shè)計儀器可以測量吸光度A值，則可以在測量溶液濃度后找到Cx=Ax/As?Cs

由于儀器的性能和實驗環(huán)境不斷變化，在采用計算方法時，必須每次測量標準液和測量液，然后使用上公式計算，否則會帶來較大的測量誤差。

由于一般光電比色計在結(jié)構(gòu)上偏離了朗伯一比耳定律，因此經(jīng)常采用標準曲線法獲得更準確的結(jié)果。

3.標準曲線法

該方法分為以下步驟：

(1)先準備五種以上標準濃度的溶液。

(2)測量每種溶液的吸光度A。

（3）做A～C如圖3所示，標準曲線圖。

溶液可以用標準的工作曲線來測量。在相同的條件下，用儀器測量A后，檢查標準曲線以獲得測量溶液的濃度值Cx。

由于光電比色計工作在可見光區(qū)域，僅適用于在有限波長下測量，且波長的半寬度較大。因此，它不能滿足不同分析工作的需要。其次，光電比色計的靈敏度也較低。為了克服上述缺點，開發(fā)了一種更好的性能分析方法：紫外分光光度法。采用單色光純度高，波長范圍寬，可連續(xù)變化，解決光電比色計存在的問題。